핵산 분자를 감지하기 위한 신호 증폭 분석 - 분기형 DNA 분석: Branched DNA assay

분기형 DNA 분석 (Branched DNA assay)

분기형 DNA 분석은 표적 증폭 분석과 반대로 핵산 분자를 감지하기 위해 사용되는 신호 증폭 분석입니다.

​분석 방법

분기형 DNA 분석에는 받침 또는 플라스틱 지지대가 사용됩니다. 이 받침에는 단일 가닥의 DNA 분자(또는 사슬)가 뿌려집니다. 이 DNA 분자들은 받침에 고착되어 노출됩니다. 이것을 포획 탐침 DNA (capture probe DNA) 분자라고 합니다. 다음으로 증량 DNA (extender DNA) 분자가 첨가됩니다. 각 증량 DNA에는 두 개의 도메인이 있습니다. 하나는 포획 탐침 DNA 분자에 혼성화(hybridization) 되고, 다른 하나는 공중에 노출됩니다. 증량 DNA의 목적은 두 가지입니다. 첫 번째는 표적 DNA 분자가 결합할 수 있는 더 많은 표면적을 생성하는 것이고, 두 번째는 다양한 표적 DNA 분자를 검출할 수 있도록 하는 것입니다.

포획 및 증량 DNA 분자가 제자리에 있고 혼성화되면 시료를 시험할 수 있습니다. 시료의 표적 분자는 증량 DNA 분자에 결합합니다. 이는 뿌려진 포획 탐침 DNA에 증량 DNA가 혼성화되게 하고, 이어서 표적 분자가 혼성화되게 합니다.

이 시점에서 신호 증폭이 발생합니다. 첫 번째 증량 DNA와 같이 두 개의 도메인을 갖는 라벨이 붙은 증량 DNA (label extender DNA) 분자를 추가합니다. 라벨 증량 DNA는 표적 DNA와 미리 증폭된 분자에 혼성화됩니다. 사전 증폭 분자에는 두 개의 도메인이 있습니다. 첫 번째 도메인은 라벨 증량 DNA와 결합하고, 두 번째 도메인은 증폭된 분자와 결합합니다. 증폭 분자의 예로는 알칼리성 탈인산화 효소(alkaline phosphatase)와 결합한 올리고뉴클레오티드 사슬이 있습니다.

분기형 DNA 분석의 과정을 플로차트로 나타내면 다음과 같습니다:

받침(지지대) --> 포획 탐침 DNA --> 증량 DNA --> 표적 DNA --> 라벨 증량 DNA --> 사전 증폭 분자 --> 증폭 분자

사용 및 장점

분기형 DNA 분석은 많은 종류의 표적 DNA 또는 RNA를 검출하고 정량화하는데 사용할 수 있습니다. 이 분석에서 분기형 DNA는 시험될 시료와 혼합됩니다. 검출은 비방사성 방법을 사용하며 검출될 핵산의 사전 증폭이 필요하지 않습니다. 이 분석법은 전적으로 혼성화에 의존합니다. 효소는 혼성화 정도를 나타내는데 사용되지만 핵산을 조작하는 데는 사용되지 않습니다. 따라서, 소량의 핵산을 (RNA의 경우) 역전사 단계 또는 PCR 없이 검출 및 정량화할 수 있습니다. 이 분석은 노동 집약적이고 많은 수의 시료로 수행하기 어려운 Northern-blotting 및 RNAse-protection 분석과는 다르게 한 번에 많은 처리량으로 실행할 수 있습니다. 특정 RNA 분자를 정량화하기 이휘 사용되는 다른 주요 높은 처리량 기술은 RNA를 cDNA로 역전사시키는 정략적 PCR (quantitiave PCR)입니다.

여러 개의 짧은 단일 가닥 DNA 분자(올리고뉴클레오티드)가 분기형 DNA 분석에 사용됩니다. 포획 DNA 및 포획-증량 DNA 올리고뉴클레오티드가 표적 핵산과 결합하고 받침에 고정됩니다. 이어서 라벨 올리고뉴클레오티드와 분기형 DNA는 고정된 표적 핵산을 검출합니다. 단단한 받침에 표적을 고정시키면 광범위한 세척이 쉬워져 오탐지 결과가 줄어듭니다. 표적을 받침에 고정시킨 후에 (알카리성 탈인산화) 효소에 연결된 분기형 DNA가 표적을 검출합니다. 분기형 DNA는 시료의 핵산에 포획 혼성화물이 결합하지 않은 지역에 특이적 혼성화로 결합합니다. DNA의 분기화는 효소가 DNA에 밀도 있게 붙어 있게 합고 이것은 분석의 높은 감도에 중요합니다. 효소는 기질의 반응을 촉매 하여 빛을 발생시키고, 이것은 광도계(luminometer)로 검출 가능합니다. 방출되는 빛의 양은 시료에 존재하는 특정 핵산의 양에 따라 증가합니다.