유전체 분석으로 염색질에 대한 접근성을 평가하기 위한 시퀀싱 기술 - ATAC-seq

 

ATAC-seq

ATAC-seq(Assay for Transposase-Accesible Chromatin using sequencing)은 염색질 접근성을 평가하기 위해 사용되는 분자생물학 기술입니다. 이 기술은 2013년에 MNase-seq(Micrococcal Nuclease sensitive site sequecning), FAIRE-seq, DNase-seq의 대체 방법으로 처음 발표되었습니다. ATAC-seq은 MNase-seq 및 DNase-seq과 비교하여 후성유전체를 더 빠르고 민감하게 분석함으로 연구원들 사이에서 인기를 얻고 있는 신기술입니다. 기능 유전체학을 향상시키기 위한 ATAC-seq은 병 발생 및 세포 분화에서 후성유전학적 조절을 이해하기 위해 사용되고 있습니다. 실제로 ATAC-seq은 후성 유전학 및 유전체 조절 연구에서 필수 도구가 되었습니다. 이것은 개방 염색질을 효율적으로 식별하고 유전체에서 조절 요소를 성공적으로 찾게 해줍니다.

기술

ATAC-seq은 시퀀싱 어댑터를 유전체의 열려있는 영역에 삽입하는 활성 돌연변이 Tn5 transposase로 염색질을 조사하여 접근 가능한 DNA 영역을 식별합니다. Tn5 transposase 돌연변이는 tagmentation이라고 불리는 과정을 통해 긴 DNA를 잘라냅니다. Tagmentation은 시퀀싱 어댑터가 미리 로딩된 Tn5 transposase로 동시에 DNA를 태깅 및 단편화(조각내기)하는 것을 말합니다. 그 후 태그가 붙은 DNA 단편을 정제하고, PCR로 증폭시키고, 시퀀싱을 수행합니다. 시퀀싱 리드(read)로 유전체의 접근 가능한 영역을 유추할 수 있고 전사 인자(Transcripton factor) 결합 부위 및 뉴클레오솜(nucleosome) 위치에 대한 영역을 맵핑하는데 사용할 수 있습니다. ATAC-seq 절차의 핵심 요소는 유전체 DNA 샘플 안의 Tn5 transposase의 활성입니다. Transposases는 전이 인자(transposon)가 유전체의 다른 부분으로 이동하는 것을 촉매 하는 효소입니다. 자연적인 transposase는 낮은 수준의 활성을 갖지만, ATAC-seq을 위한 돌연변이 transposase는 높은 활성을 갖습니다.

적용 방법

ATAC-seq의 가장 일반적인 사용은 뉴클레오솜 맵핑(nucleosome mapping) 실험입니다. 이를 위해 ATAC-seq 분석은 인간 암에서 전장 유전체적 염색질 접근성 환경 및 enhancer 예측과 같은 다수의 염색질 관련 특징을 조사하기 위해 사용됩니다. 고해상도 enhancer 맵핑의 유용성은 (인간과 침팬지의) 발달 과정 중 enhacer 사용의 진화적 분화 연구에서부터 혈액 세포 분화에 사용되는 계통 특이적 enhancer map을 발견하는 것까지 다양합니다. 가장 최근 ATAC-seq은 황반 변성(macular degeneration)과 관련된 염색질 접근성의 유전체적 감소를 나타내기 위해 사용되었습니다. ATAC-seq으로 세포 특이적 결합 부위 및 세포 특이적 활성을 갖는 전사 인자 예측을 위해 사용할 수도 있습니다.

Single-cell ATAC-seq

향후 몇 년 동안 ATA-seq은 단일 세포 분석에 일반적으로 사용되는 기술이 될 것입니다. ATAC-seq은 적은 세포 수에 최적화되지는 않았지만 프로토콜을 수정하여 이를 수용했습니다. 미세유체학(microfluidics)을 시용하여 단일 핵을 분리하고 ATAC-seq 반응을 개별적으로 수행할 수 있습니다. 처리량이 높은 방법인 조합 세포적 인덱싱(combinatorial cellular indexing)은 바코드를 사용하여 수천 개의 세포에서 염색질 접근성을 측정할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 실험 당 17,000개가 넘은 세포를 볼 수 있지만, 이 기술은 실제로 단일 세포 분석이 아닙니다. 단일 세포 후성유전체학(single celll epigenomics)으로 세포별 염색질 접근성을 밝혀낼 수 있습니다. Single-cell ATAC-seq을 사용하면 발달 계통 추적을 위한 세포 종류와 상태를 식별할 수 있습니다. ATAC-seq은 포괄적인 후성 유전체학 워크플로의 핵심 구성 요소가 될 것입니다. 전장 유전체의 히스톤 변형(histone modification), DNA 메틸화(DNA methylation), 유전자 발현, 염색질 접근성에 대한 통합 분석이 점점 일반화되고 있습니다. 이러한 모든 구성 요소를 함께 검사하기 위한 단일 실험 워크플로도 준비 중입니다. ATAC-seq의 용이성, 속도, 신뢰성, 다중화 가능성으로 인해 워크플로 중 염색질 접근성에 대한 부분을 잘 충족합니다.

효율성 및 제원

차세대 시퀀싱(NGS)을 통한 개방 염색질(open chromatin)을 평가하는 방법은 수년 동안 사용되었습니다. 기존 방법에 비해 ATAC-seq의 주요 장점은 라이브러리 준비 프로토콜의 단순성입니다. Tn5 삽입 후 2번의 PCR을 하면 됩니다. 라이브러리 준비 후, DNA는 NGS 기술로 시퀀싱 되며, 영역에 대한 read 개수는 염색질이 얼마나 개방되지 있는지 단일 뉴클레오티드 수준으로 확인할 수 있습니다. ATAC-seq은 FAIRE-seq과 같은 초음파 처리 또는 페놀-클로로폼(phenol-chloroform) 추출이 필요 없고, ChIP-seq에 필요한 항체가 필요 없고, MNase-seq 및 DNase-seq에 필요한 민감한 효소 분해과정이 없습니다. 완료하는데 최대 4일이 소요되는 이런 유사한 방법과는 달리 ATAC-seq 준비는 3시간 이내에 완료될 수 있습니다.

ATAC-seq 프로토콜의 다른 고려 사항은 세포 개수입니다. 세포의 총 수는 라이브러리의 복잡성을 정의하지만 세포 수가 너무 적으면 결과가 과소평가되고, 세포 수가 너무 많으면 과대평가됩니다. 따라서 처음부터 세포 수를 최적화하는 것이 중요합니다. 인간 연구의 경우 500 ~ 50,000개의 세포가 권장되지만 종과 세포의 유형에 따라 달라집니다.

ATAC-seq의 장점은 다음과 같습니다.

1. 필요한 생물 시료의 양이 적음 - 최소 1,000배 더 많은 시료를 필요로 하는 MNase-seq 및 DNase-seq과 달리 ATAC-seq은 50,000개의 세포 면 충분합니다.

2. 속도 - 전체 프로토콜에 총 3시간이 필요합니다.