단백질의 안정성 및 기능 예측 - 알라닌 스캐닝: Alanine scanning

알라닌 스캐닝

알라닌 스캐닝(alanaine scanning)은 특정 단백질의 안정성 및 기능에 대한 특정 잔기의 기여를 측정하는 기술입니다. 알라닌이 사용되는 이유는 크기가 크지 않고, 화학적으로 불활성이며, 다른 아미노산들이 가지고 있는 이차 구조 선호도를 모방하는 메틸 작용기 때문입니다. 때때로 돌연변이 잔기의 크기를 보존해야 하는 경우 크기가 큰 아미노산인 발린(valine)과 류신(leucine)이 사용되기도 합니다.

이 기술은 특정 잔기의 측쇄(side chain)가 생물활성에 중요한 역할을 하는지에 대한 여부를 결정하는데 사용할 수도 있습니다. 이것은 일반적으로 부위 특이적 돌연변이 유도(site-directed mutagenesis) 또는 PCR 라이브러리를 무작위로 생성함으로써 수행할 수 있습니다. 또한 이론적 알라닌 치환에 기반한 열역학적 매개변수(parameter)를 추정하는 컴퓨터적 계산 방법이 개발되었습니다.

이 기술로 많은 측쇄를 빠르게 동시에 분석할 수 있고 단백질 정제와 생물 물리 분석을 피할 수 있습니다. 현재 이 기술은 매우 발전하여 다양한 생화학 분야에서 사용되고 있습니다. 이러한 데이터는 IR, NMR 분광법, 수학적 방법, 생체 분석 등으로 확인할 수 있습니다.

알라닌 스캐닝의 좋은 예제는 단백질 표면의 하전된 잔기(charged residue)의 역할을 검사하는 것입니다. 상피 소듐 채널(epithelial sodium channel, ENaC) 표면의 하전된 잔기의 역할에 대한 체계적 연구는 알라닌 스캐닝으로 세포 표면까지 단백질의 운반 과정에서 하전된 잔기의 중요성을 밝혀내었습니다.

​적용 방법

알라닌 스캐닝으로 인간 성장 호르몬과 수용기의 세포 외 도메인 사이에 묻힌 19개 측쇄의 기능을 동시에 측정하였습니다. 측쇄의 각 아미노산은 알라닌으로 치환되었습니다. 이어서 알라닌 스캐닝 돌연변이 유도(alanine scanning mutagenesis)와 파지 디스플레이(phage display) 기술과 이항 돌연변이 유도(binomial mutagenesis) 기술을 조합한 샷건 스캐닝(shotgue scanning) 방법이 사용되었습니다.

알라닌 스캐닝의 또 다른 적용 방법은 원형적 시클로타이드 칼라타 B1(cyclotide kalata B1)에서 각 잔기의 구조와 활성에 대한 영향을 결정하는 것입니다. 사이클로타이드는 넓은 범위의 약리적으로 중요한 생물활성을 보여줍니다. 하지만 이것의 자연적인 기능은 식물의 방어에 사용되는 살충제입니다. 시클로타이드 칼라타 B1에서 23개의 모든 비시스테인 잔기(non-cysteine resiude)가 알라닌으로 치환되었습니다. 이 데이터는 NMR 분광법으로 인해 확인되었습니다.

알라닌 스캐닝은 Cry4Aa의 어떤 기능적 모티프가 살모기제 활성을 갖는지 결정하는 연구에도 사용되었습니다. Cry4Aa는 Bacillus thuringiensis에 의해 생산됩니다. 이것은 파리(쌍시)류 특이적 독소이며 모기를 통제하기 위해 생물 살충제를 생성하는데 중요한 역할을 합니다. 따라서 Cry4Aa의 어떤 기능적 모티프가 이런 활성에 기여하는지 결정하는 것은 매우 중요합니다. 이 연구는 수용기의 잠재적 결합 부위의 잔기를 알라닌으로 치환하여 몇몇 돌연변이 Cry4Aa를 만들어 냈습니다. 이후 빨간집모기(Culex pipiens)를 가지고 생체 분석을 수행하였습니다.