표적 DNA를 찾기 위한 탐침 - 대립 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드: Allele-specific oligonucleotide

대립 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드

대립 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드(Allele-specific oligonucleotide, ASO)는 가변적 표적 DNA 서열에 상보적인 짧은 합성 DNA입니다. 이것은 서던 블롯(Southern blot) 분석 도는 닷 블롯(Dot blot) 분석에서 표적의 존재에 대한 탐침(probe) 역할을 합니다. 이것은 유전자 검사, 법의학 분석, 분자생물학 연구에 자주 사용되는 일반적인 도구입니다.

ASO는 일반적으로 15-21개의 뉴클레오티드 염기로 이루어져 있습니다. 이것은 표적이 되는 DNA의 특정 버전 또는 대립 유전자 특이적으로 설계되고 사용됩니다. 선택되는 가닥의 ASO 길이 및 표적 DNA와의 결합 조건은 모두 특이성에 중요한 역할을 합니다. 이러한 탐침은 일반적으로 표적으로 하는 유전적 서열의 1개의 염기 차이도 감지할 수 있도록 설계됩니다. 이러한 능력은 인간 게놈 프로젝트와 유전형 분석의 단일 염기 다형성(single nulceotide polymorphism, SNP) 분석에 필수적입니다. ASO가 표적에 결합한 후 감지되려면, ASO에 방사성 효소 또는 형광 표지가 붙어 있어야 합니다. 일루미나 메틸화 분석(Illumina Methylation Assay) 기술은 ASO의 이점을 이용하여 특정 CpG 부위에서 메틸화를 측정하기 위해 하나의 염기 쌍 차이(예: 시토신 대 타이민)를 감지합니다.

예제

인간의 질병인 겸상 적혈구 빈혈(sickle cell anemia)은 혈액 단백질 베타 헤모글로빈(beta-haemoglobin)의 여섯 번째 아미노산이 유래되는 코돈(codon)에 유전적 돌연변이에 의해 발생합니다. 정상적인 DNA 서열인 GAG는 글루타메이트를 코딩하는 반면, 가운데 아데닌이 타이민으로 바뀐 GTG 돌연변이는 발린을 코딩하고 단백질의 구조를 왜곡시킵니다.

위) 일반적 서열에 붙은 ASO 탐침, 아래) 돌연변이에 붙은 ASO 탐침 By PaleWhaleGail at English Wikipedia, CC BY-SA 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=46986819

샘플 DNA에 돌연변이가 있나 확인하기 위해 표적 서열에 상보적인 ASO 탐침을 합성합니다. 이 ASO는 돌연변이가 없는 표적 서열에 대해 완전히 상보적이고 강하게 결합합니다. 그러나 돌연변이가 있느 비표적 대립 유전자에는 단일 미스매치(mismatch)가 있어서 약한 상호작용을 보입니다.

샘플 DNA 안의 베타 헤모글로빈 유전자의 일부분은 PCR에 의해서 증폭될 것이고, 여기서 나온 생성물은 닷 블롯에 사용됩니다. 샘플 DNA 가닥은 알칼리에 의해 분리되고, 각 ASO 탐침은 다른 블롯에 적용됩니다. 하이브리드 형성(hybridization) 후 완전히 상보적인 하이브리드와 불일치하는 하이브리드를 구별할 수 있는 세척 프로토콜이 사용됩니다. 일치하지 않는 ASO는 블롯에서 씻겨 나가는 반면, 일치하는 ASO는 남아 있습니다.

By PaleWhaleGail (talk) - self-made, CC BY-SA 3.0, https://en.wikipedia.org/w/index.php?curid=16437779

위 그림에는 6개의 증폭된 샘플 DNA 가 두 개의 블롯에 각각 적용되었습니다. 세척 후 남아있는 ASO 표지의 검출은 각각 두 카피의 베타 헤모글로빈 유전자에 대한 샘플의 유전형을 직접 판독할 수 있게 해줍니다. 샘플 1번, 4번만 정상 대립 유전자(A)를 갖는 반면, 샘플 3번, 5번은 정상(A) 및 비정상(S) 유전자를 모두 갖고 있는 것으로 나타났습니다. 샘플 2번, 6번은 비정상 유전자만을 가지며 질병의 영향을 받을 것입니다. 적은 양의 혼성 하이브리드 형성은 일반적이며 최종 결과를 확인하는데 고려됩니다.

대체 방법

ASO 분석은 유전자 다형성을 감지하는데 사용되는 방법 중 하나일 뿐입니다. 직접적인 DNA 시퀀싱은 초기에 돌연변이를 확인하는데 사용되지만, 일상적인 스크리닝에 사용하기는 매우 힘듭니다. 이전 방법인 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)는 미리 서열 변화를 알 필요 없지만, 돌연변이가 제한 효소의 절단 부위에 영향을 주어야 했습니다. RFLP 분석은 올리고뉴클레오티드 탐침의 사용에 간단히 적용되었지만, 이 기술은 중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR) 증폭 DNA에 대한 ASO 분석에 의해 빠르게 대체되었습니다. 이 PCR 기술 자체는 대립 유전자 특이적 PCR로 다형성을 감지할 수 있도록 적용되었습니다. 그러나 PCR/ASO 결합 방법의 단순성과 범용성은 비방사성 표지와 함께 이 기술을 계속 사용되게 했습니다.

역사

유전자 서열 변이에 대한 특이적 탐침으로서 합성 올리고뉴클레오티드의 사용은 캘리포니아 City of Hope National Medical Center의 R. Bruce Wallace에 의해 개발되었습니다. 1979년 Wallace와 그의 동료는 세균 바이러스의 단일 가닥의 변이를 감지하기 위해 ASO 탐침을 사용했다고 보고했습니다. 그리고 나중에 이 기술을 복제된 인간 유전자에 적용하였습니다. 1983년과 1985년 Wallace의 연구실에서는 전장 유전체 DNA 샘플에서 겸상 적혈구 빈혈에 대한 돌연변이 감지를 보고 했지만, 이 방법은 ASO가 소량의 표지 밖에 운반할 수가 없어서 어려움이 있었습니다.

다행히도 1985년 DNA의 특정 부분을 증폭시키는 방법인 PCR이 보고되어, 1년 안에 ASO는 PCR과 짝을 이루었습니다. 이 조합은 표적 DNA의 양을 백만 배 이상 증폭 시킬 수 있었기 때문에 ASO 표지에 대한 문제를 해결했습니다. 또한, PCR 과정 자체의 특이성은 ASO 탐침의 특이성과 더해질 수 있어서 비표적 서열과의 거짓 결합 문제를 크게 감소시킬 수 있었습니다. 이 조합은 힘들고 비효율적인 서던 블롯 방법을 피하면서 간단한 닷 블롯에 사용할 수 있을 만큼 구체적이었습니다.